日前，中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所钟超课题组、周佳海课题组与深圳未知君谭验团队合作在Nature Chemical Biology（IF=16.284）上发表构筑活材料的“IT+BT”新范式，题为“Accelerating the design of pili-enabled living materials using an integrative technological workflow”。该工作通过联合生物信息学、结构生物学和合成生物学的技术方法，实现了对合成特定生物聚合物工业菌株的高通量挖掘和筛选、生物聚合物组装机制的解析以及新型活材料的理性设计，搭建出快速开发新型活材料的“IT+BT”新范式（图1）。

中科院深圳先进技术研究院黄园园助理研究员为本文第一作者，中科院深圳先进技术研究院钟超研究员、周佳海研究员和未知君的谭验博士为文章共同通讯作者。另外深圳先进技术研究院的科研助理吴彦霏和博士生王杰，深圳未知君的胡函博士和童邦卓工程师，深圳先进技术研究院李楠老师课题组，上海蛋白质中心的彭超研究员和殷跃博士以及课题组的其他同学也对该工作也做出了重要贡献。

 
图1 开发新型活材料的IT+BT新范式。

工程活材料（ELMs），是合成生物学与材料科学领域交叉发展衍生出的新兴领域。自组装的活体功能材料是当前活材料的重要组成部分，它是由活细胞和其自编程的生物聚合物共同组成。自组装的活体功能材料具有自生长、自适应、可进化等“活”的生命属性，并在生物传感、生物修复、疾病治疗和智能材料制备等领域表现出广阔的发展前景。然而，在当前自组装的活体功能材料的开发中，具有可编程生物聚合物基元的底盘细胞匮乏，使构筑具有更多功能且能满足不同应用场景的微生物活材料受限，并成为阻碍ELMs领域进一步发展的重要因素。

为了解决上述瓶颈，研究团队首先开发了软件BBSniffer（图2a），用于挖掘自然界中具有合成特定生物聚合物菌株，并为用户推荐出可用于下一步工程新型“活材料”的底盘细胞。用户仅需在软件中输入感兴趣的生物聚合物(包括蛋白质、多糖和其他生物聚合物)相关的专业术语，BBSniffer就可以从庞大的细菌基因组数据库中，搜索出合成相关生物聚合物基因簇的所有菌株，并通过软件内置的细菌分类数据库对菌株进行致病菌、工业菌株和其它菌株的分类及打分后，便可为用户生成用于下一步工程新型“活材料”的候选菌株参考列表。

 
图2 开发软件BBSniffer用于挖掘自然界中合成靶标生物聚合物的菌株。

然后，研究团队以“共价交联型菌毛”作为示例（图2b-e），对自然界中合成此类蛋白质纤维的菌株进行筛选和分类后，挖掘出102株工业菌株中具有合成共价交联行菌毛的基因簇；通过对挖掘到的工业菌株进行进化树分析后，生成相对于参考菌株（研究共价交联型菌毛中的模式菌株，致病菌白喉杆菌）的亲缘关系距离打分文件；根据距离打分文件，BBSniffer推荐排名前五中，易培养且基因组可编辑的工业菌株谷氨酸棒状杆菌ATCC14067，作为下一步开发基于共价交联型菌毛的新型微生物活材料的底盘。

解析新型生物聚合物的组装机制有利于下一步对其进一步的工程改造。因此，研究者以BBSniffer推荐的工业菌株谷氨酸棒状杆菌作为研究对象，通过基因敲除和形貌表征的方法，揭示了BBSniffer挖掘出的谷氨酸棒状杆菌中共价交联型菌毛（Spa菌毛）是由次要蛋白Spa1，Spa2和骨架蛋白Spa2共同组成（图3a）。然后，通过质谱鉴定（图3b），揭示了分选酶催化切割Spa2单体上的尾部氨基酸T477，其上的羰基与另一个Spa2单体上的K194侧链上的氨基缩合脱去1分子的水，从而形成分子间的异肽键，实现骨架蛋白单体间的聚合。此外，通过联合质谱鉴定、X-ray晶体衍射技术和体内验证实验（图3c-e），揭示了Spa2蛋白单体内的三对分子内异肽键（K57-N195，K203-N318和K355-N466）和二对二硫键（C97-C128和C380-C432）在纤维形成中的重要作用。

 
图3 谷氨酸棒状杆菌中Spa菌毛纤维的组成和组装机制。

在对Spa菌毛纤维形成机制解析的基础上，研究者对Spa菌毛的骨架蛋白Spa2进行理性设计，构建出了基于Spa菌毛的新型可编程细胞外蛋白质支架（图4）。首先，研究者用mCherry作为报告蛋白，尝试将其融合在Spa2的信号肽之后以及不含二硫键的M-domain的不同loop区域，结果表明这些位点都能够装载mCherry并可以形成纤维结构；此外，通过在Spa2上装载不同类型/大小的功能性肽段/蛋白/酶，也能够在细胞外形成功能性的纤维；以上的结果表明，Spa菌毛可以被工程为细胞外的蛋白支架，用于在细胞外装载不同功能性的蛋白。 而后，研究者通过将Spa2单体同时融合分割的绿色荧光蛋白Venus的氨基端和羧基端，结果发现重组的细胞表面实现了荧光的互补，这表明可编程的Spa菌毛蛋白支架也可以用于细胞外多个蛋白的共组装。

 
图4 开发基于Spa菌毛的新型可编程细胞外蛋白质支架。

以上的研究表明，工程的Spa菌毛蛋白支架也可以用于细胞外多个蛋白的共组装，可应用于细胞外的酶促级联反应中。因此，研究者通过在骨架蛋白Spa2上融合多个纤维素酶（图4a），实现了在体外将粘稠的纤维素降解为细胞可以利用的葡萄糖（图4b-c）；此外，通过工程工业菌株谷氨酸棒状使其具有生产番茄红素的能力（图4d）。总的来讲，研究者通过结合工程细胞所具有的细胞外降解纤维素为葡萄糖，细胞内利用葡萄糖生产高附加值化合物的能力，构筑出具有降解废弃物为高附加值化合物的新型活体功能材料。

图5 基于谷氨酸棒状杆菌中可编程的Spa菌毛构筑将纤维素转化为高附加值化合物的新型活体功能材料。

综上所述，本研究通过利用IT技术，实现了对自然界中生产生物聚合物菌株的的挖掘、分类以及分析，可以快速为科研工作者提供合适的候选菌株用于新型活材料的工程；通过BT技术，实现对挖掘到的新型生物聚合物机制的解析，推进可编程生物聚合物的设计，以实现新型活材料的快速构筑。本研究为新型“活材料”的开发提供了“IT+BT”的新范式，将简化并加速新型活材料的开发，并将为活体功能材料领域提供更多具有可编程生物聚合物的底盘细胞。

据介绍，此次研究，未知君与中国科学院深圳先进技术研究院采用了“干实验（数据与生物信息）”+“湿实验（细胞层面）”相结合的合作模式；其中，未知君主要负责数据与生物信息层面的实验与研究。未知君团队主导开发的BBSniffer软件，是一款生物聚合物基因簇挖掘和高产生物聚合物菌株推荐的合成生物学工具，在此次研究中扮演重要角色。

依托于2022年9月，未知君与中国科学院深圳先进技术研究院共同设立的“BT-IT材料创新”联合实验室，双方不断整合、优化、扩大工程菌的挖掘范畴，推动技术端的前沿研究，以及产业端的新产品开发等工作。未知君研究团队成员介绍，此次发表的成果，以及不断优化的BBSniffer软件，将在后续对工程菌的研究与筛选提供更高效的工具和更有力的科学支持，推动合成生物学在生物医药、工业、材料等领域的落地应用。

该工作获得了国家重点研发计划、国家杰出青年科学基金、国家青年科学基金和广东省基础与应用基础研究基金等项目的支持以及深圳市微生物药物智能制造重点实验室、深圳合成生物学创新研究院和定量合成生物学重点实验室等平台的支持。

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